１５６８年(永禄11)、足利義昭擁して入京し、幕府を再興して将軍職につけた。しかし実権は信長が握っいたので両者の関係は急速に悪化した。
義昭は浅井・朝倉・武田氏や本願寺に反信長戦線の結成を促した。信長は苦境に陥るが、１５７０年(元亀１)、徳川家康の同盟を得て、姉川合戦で浅井・朝倉連合軍を破り、そして、小谷城攻めで朝倉義景・浅井久政・長政を滅ぼした。朝倉攻めのさい、長政の離反にあつて九死に一生を得た信長は、その怨みを忘れず、長政らの頭蓋骨に金泥を塗り、酒宴で披露したという。